Arbeidsprinsippet til en Pasteur-pipette er primært basert på tyngdekraft-drevet strømning og kapillærvirkning, kombinert med manuell kontroll av lufttrykkdifferanser for å lette aspirasjon og overføring av væsker.
Manuell sugekontroll: Operatøren påfører sug til den brede enden av pipetten -enten oralt eller ved hjelp av en ekstra gummipære-for å skape undertrykk inne i røret, og trekker derved væske inn i den fine spissen.
Tyngdekrafts-drevet dispensering: Når suget slippes, renner væsken naturlig ut under påvirkning av tyngdekraften; dispensering kan også assisteres ved å forsiktig klemme pipettekroppen eller vippe mottakerkaret.
Dråpereproduserbarhet: Ved å kalibrere forholdet "dråper per milliliter" muliggjør pipetten omtrentlig kvantitativ overføring, noe som gjør den egnet for prosedyrer som krever repeterbarhet i stedet for absolutt presisjon.
Sterilitetssikring: Før bruk kan en bomullsplugg settes inn i den brede enden og steriliseres for å forhindre mikrobiell kontaminering under håndtering-en praksis som er spesielt vanlig i mikrobiologiske eksperimenter.